Метод фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) широко используется для оценки диаметра частиц в растворе. В данной работе были определены диаметры белковых комплексов, образующихся при взаимодействии церулоплазмина (ЦП) с лактоферрином (ЛФ) и/или миелопероксидазой (МПО). Получена калибровочная зависимость диаметра белковых частиц (миоглобин, альбумин, ЛФ, ЦП, МПО, альдолаза, ферритин) от логарифма их молекулярной массы. Диаметр комплекса, образующегося при смешивании ЦП и ЛФ, составил 8,4 нм, что согласуется с радиусом вращения, полученным ранее при исследовании комплекса 1ЦП-1ЛФ методом рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами. Диаметр комплекса, образующегося при взаимодействии ЦП и МПО, равен 9,8 нм, что соответствует стехиометрии 2ЦП-1МПО. Диаметр комплекса, образующегося при добавлении ЛФ к комплексу 2ЦП-1МПО, составляет 10,7 нм. Такой диаметр предполагает образование пентамера: 2ЛФ-2ЦП-1МПО с молекулярной массой около 585 кДа.
Соколов А.В., Прозоровский В.Н., Васильев В.Б. (2009) Исследование взаимодействия церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы методом фотонной корреляционной спектроскопии. Биохимия. Т. 74, №11, С. 1506-1509

В работе впервые описан спектрофотометрический метод определения пероксидазной активности миелопероксидазы (МПО) в плазме крови человека с использованием в качестве субстрата о-дианизидина (o-DA). Определены оптимальные условия (рН, концентрация Н2О2), при которых основной вклад в реакцию окисления o-DA плазмой вносит МПО. Определение концентрации МПО проводили с помощью оригинального иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител, полученных иммунизацией крыс и кроликов. Разработанный нами ИФА характеризуется высокой чувствительностью (0.2-250 нг/мл). Между активностью МПО, определенной спектрофотометрическим методом, и уровнем МПО, измеренным с помощью ИФА, в плазме крови 38 здоровых доноров выявлена достоверная положительная корреляционная зависимость (Р<0.0001). Предложенные новые подходы к определению МПО в плазме могут быть использованы для оценки концентрации и активности фермента, а также эффективности механизмов, регулирующих и ингибирующих функцию МПО в физиологических условиях и при различных воспалительных заболеваниях.
Горудко И.В., Черкалина О.С., Соколов А.В., Пулина М.О., Захарова Е.Т., Васильев В.Б., Черенкевич С.Н., Панасенко О.М. (2009)Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека. Биоорганическая химия. Т. 35, №5, С. 629-639

Для оценки хлорирующей активности миелопероксидазы и влияния на нее церулоплазмина и лактоферрина в составе комплексов миелопероксидаза-церулоплазмин и миелопероксидаза-церулоплазмин-лактоферин использовали метод хемилюминесценции люминола. Впервые показано: добавление Н2О2 в систему «миелопероксидаза+Cl?+люминол» сопровождается быстрой вспышкой хемилюминесценции; интенсивность вспышки резко снижается в отсутствие миелопероксидазы или Cl?; ингибитор миелопероксидазы – NaN3, перехватчики HOCl – таурин или метионин, а также субстрат пероксидазного цикла миелопероксидазы – гваякол предотвращали свечение. Сделано заключение, что наблюдаемая хемилюминесценция обусловлена функционированием цикла галогенирования миелопероксидазы, а регистрируемая светосумма является мерой хлорирующей активности фермента. Сравнительный анализ влияния церулоплазмина на активность миелопероксидазы, проведенный тремя независимыми методами (хемилюминесценция, определение хлорирующей активности миелопероксидазы с помощью таурина, а также измерение ее пероксидазной активности) показал, что церулоплазмин ингибирует функцию миелопероксидазы. Лактоферин сам по себе не оказывал достоверного влияния на активность миелопероксидазы. Будучи встроенным в тройной комплекс миелопероксидаза-церулоплазмин-лактоферин, лактофеприн не препятствовал ингибирующему эффекту церулоплазмина в отношении миелопероксидазы. Важно отметить, что ингибирующий эффект церулоплазмина в отношении хлорирующей и пероксидазной активности миелопероксидазы, зарегистрированный традиционными методами, проявляется лишь при весьма значительном избытке церулоплазмина по отношению к миелопероксидазе, тогда как метод хемилюминесценции позволяет выявить ингибирование миелопероксидазы при малых стехиометрических соотношениях белков, которые реально имеют место в комплексах миелопероксидаза-церулоплазмин и миелопероксидаза-церулоплазмин-лактоферин. Для выяснения механизма влияния церулоплазмина на миелопероксидазу был проведен анализ его ингибирующей активности, который показал, что церулоплазмин тем эффективнее ингибирует пероксидазную активность миелопероксидазы, чем бо'льшие молекулярные размеры имеет субстрат. Таким образом, ингибирующий эффект церулоплазмина на уровне комплекса миелопероксидаза-церулоплазмин связан со стерическими препятствиями для связывания субстратов миелопероксидазы, возникающими за счет белок-белковых взаимодействий.
Панасенко ОМ, Чеканов АВ, Власова ИИ, Соколов АВ, Агеева КВ, Пулина МО, Черкалина ОС, Васильев ВБ. (2008) Влияние церулоплазмина и лактоферрина на хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом хемилюминесценции.// Биофизика. Т. 53, С. 573-581.